2020年6月发表在《Journal of Human Genetic》的一篇研究中，作者利用全基因组技术在脑白质营养不良基因(POLR3A)上发现1个深度内含子突变(c.645+312C>T），利用SpliceAI算法、RT-PCT技术、结合受检者临床表型、已检出杂合突变(全外显子测序，c.1451G>A），最终为该病例从分子层面进行了确诊，提示全基因组测序技术是研究内含子区域变异、提高疾病诊断率的有效技术。
展开剩余85%研究背景与点评
◆ 全外显子测序技术在脑白质病群体中诊断率约为40%，内含子变异是未确诊病例的潜在致病因素；
◆ 在神经发育障碍或其他罕见遗传病的患者中，约10%的致病突变可能包含非编码突变，这种突变会破坏剪接，导致蛋白质功能异常；
◆ 全基因组测序技术是目前无偏倚研究内含子区域最全面的检测技术；
◆ 目前已有多种软件可以对内含子变异进行较为准确的功能预测（如2019年1月发表在Cell期刊的SpliceAI 软件，已有多篇研究发表)，结合RNA-seq等测序技术辅助，可以快速对内含子变异致病性进行深入研究；
◆ 利用全基因组测序技术发现POLR3A基因上存在1个深度内含子突变，对全外显子测序结果进行有效补充，为1例脑白质病患者找到了发病原因；
◆ 2019年6月份，在中华儿科杂志上发表《全基因组测序在遗传病检测中的临床应用专家共识》，同期杂志也发表了《临床全基因组时代元年》的文章，全基因组测序的应用将越来越广泛。
病例简介
❶ 36周娩出，无神经发育疾病家族史；
❷ 出生体重、体长、头围分别为3130g（2.0 SD）、47.6cm( 0.46 SD)、33.0cm(0.47 SD)；
❸ 2周发现喉软骨软化，1岁后持续出现呼吸系统感染；
❹ 1岁3个月可独立行走，但3岁才可独立上下楼梯；
❺ 3岁诊断为智力障碍、自闭症；
❻ 10岁，体重、身高、头围分别为19.8kg（-2.0 SD）、128.0cm( -1.9 SD)、50.2cm(-2.1 SD)；
❼ 中度张力减退，腱反射正常；颌骨正位全景断层照片显示第二磨牙缺损；
❽ 11岁头部核磁显示髓鞘形成减少、小脑萎缩、胼胝体变薄。
图1 头磁共振结果
a 全外显子测序发现1个与表型高度相关的突变（POLR3A，NM_007055.3,c.1451G>A），该变异为低频突变且多种基因变异软件预测工具预测该变异对蛋白功能影响较大，但未发现第二个突变，与POLR3A基因遗传方式不符（AR遗传）,无法从分子层面进行确诊；
b 鉴于该受检者表型与POLR3A基因相关脑白质营养不良高度相似，故对受检者进行全基因组检测，分析发现该基因存在1个深度内含子突变(NM_007055.3,c.645+312C>T）,根据SpliceAI预测，该变异会导致1段Alu序列外显子化；
图2 全外显子与全基因组测序发现受检者POLR3A基因上存在1个错义突变和深度内含子突变
图3 SpliceAI预测显示POLR3A基因深度内含子突变会导致外显子5和外显子6之间插入129bp序列
c Sanger家系验证分析发现，检出POLR3A2基因2个变异分别遗传自受检者父母，符合遗传规律，高度提示为受检者发病原因；
图4 家系Sanger验证结果
d 为进一步验证检出内含子变异致病情况，通过RT-PCR技术验证，患者因该内含子变异存在不同大小的插入片段；
图5 RT-PCR电泳结果
e 进一步分析发现，在该基因外显子5和外显子6之间插入129个碱基，导致蛋白编码提前终止(p.Leu216Met*39)。
图6 插入变异示意图
结论
在本研究中，利用全外显子测序技术及全基因组测序技术对1例脑白质病例进行了分子确诊，其中全基因组测序技术发现1个深度内含子突变，提示在疑似遗传病患儿基因诊断过程中要注意内含子区域、UTR区域等全外显子测序技术分析不到的范围，尤其是对于隐性遗传病病例只检出1个致病突变的情况。
参考文献
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[4] 余永国等. 全基因组测序在遗传病检测中的临床应用专家共识[J]. 中华儿科杂志, 2019, 057(006):419-423.
[5] 张强, 何丽, 沈亦平. 临床全基因组时代元年[J]. 中华儿科杂志, 2019, 057(006):401-404.
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